“我们要向所有国家传递一个简单的信息:检测,检测,再检测。”3月16日,世界卫生组织总干事谭德塞发出加强检测的呼吁,“谁也不可能蒙住双眼救火。如果不知道谁被感染了,就无法阻止这场大流行。”
然而实际情况却是,疫情蔓延之下,不少国家面临实验室检测能力即将被“压垮”的境地。
有人设想,若充满危险的病毒检测可以简单到像额温枪测体温一样,一切问题都将迎刃而解。你觉得可能吗?如果答案不敢肯定,那么,你至少可以感受到:今天在实践中证明的东西,就是过去在想象中存在的东西。
面对大量新冠疑似病例需要紧急确诊的情况,基层已成为筛查诊断的重要“战场”。
传统的核酸检测要求具备生物安全二级及以上实验室条件和生物安全三级实验室级别的个人防护,限定了应用场景是高等级疾控、三级医院等有限资质机构,再加之耗时长,大大限制了其作用的发挥。
2月8日,国家科技部发布《新型冠状病毒(2019-nCoV)现场快速检测产品研发应急项目申报指南》,面向社会广泛征集新型冠状病毒的现场快速检测产品,突破现有检测技术对人员、场所的限制,缩短检测用时,提升便捷程度,推动诊断前移下移,实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查。
为满足疫情防控需求,依托自身在分子检测领域累积多年的科研成果与技术实力,核工业总医院正在推进“新冠病毒POCT核酸系统”研发,包括用于即时、随地检测的POCT设备和与之匹配的核酸检测试剂盒,并力图解决现有新冠病毒检测技术存在一定诊断误差等科学性难题。
目前,该项目进展顺利吗?离实现应用的距离还有多远?具体可将检测时间“压缩”到多短?带着这些问题,本刊记者采访了该项目负责人、核总医院临床微生物学重点实验室主任杜鸿。
将检测时间“压缩”至30分钟
有人说,治病救人就是从死神手中抢人,必须学会和时间赛跑。殊不知,一场与病魔的较量从确诊前就已开始。
杜鸿告诉记者,目前来看,传统的病毒核酸检测方式普遍需要2个小时以上。
这一时间基本就是核酸扩增所耗费的时间。
核酸检测必须使样本中的核酸基因组达到一定数量即扩增之后,才能实现检测,这一环节包含了变性、退火、延伸三个步骤。
采用定量荧光PCR(核酸扩增技术)的传统核酸检测方法,由于方法学上的限制,上述三个步骤需要分别在不同的温度下依次进行,“变性约需要90多度,退火约50多度,延伸约70多度。”若三个步骤能同时进行,时间将大大缩短。
“新冠病毒POCT核酸系统”创新采用的环介导等温PCR为这一设想提供了现实可行方案。
“环介导等温PCR关键就是通过技术改进,在恒温条件下进行扩增反应,不需频繁变温,相当于让传统的三个步骤同时并行,再加上一些优化,最终使时间缩短到原来的1/4,也即半个小时就可以完成核酸扩增,获得检测结果。”杜鸿解释道。
在极大地简化检测流程的同时,他们的研发还将多步骤的核酸检测方法整合到一个系统内,最终设计出只比手掌大一些的便携式检测设备(POCT)。
杜鸿说,操作这一设备,理论上无需专业PCR实验室、无需PCR复杂手工操作步骤等,极大降低了检测设备、技术人员的成本投入,具有省时、简单等优点。
但他亦表示,虽然从技术层面看该设备操作简单,可以说是“人人都能上手”,但根据目前国家相关规定,他预测该设备投入使用后,还是需要具有检测资质的人员才能操作,在人员防护方面仍需按照三级防护去做。
除了当前的研发任务,项目团队还有着更大的“野心”。目前,该项目研发的POCT设备只能实现从核酸检测、探针取位到出具结果这些环节功能部件的嵌入。未来,他们想要挑战将前期的取样、核酸提取环节一并纳入到POCT体系中,让这一系统真正实现“样本进、结果出”的“一条龙”检测服务。
解决核酸检测“假阴性”高这一行业痛点
除了便携,并缩短检测时间,该系统最大的优势还在于能提高核酸检测的准确率。
虽然核酸检测是公认的新冠肺炎诊断的“金标准”,但检测结果的“假阴性”比率居高不下,也一度使之饱受质疑。
除去取样方式方法、实验室自身检测条件等外在影响因素外,“新冠病毒POCT核酸系统”的研发将从技术层面助力解决这一行业痛点。
核酸检测试剂盒的原理简单来说,就是利用探针在扩增后的病毒样本中选择合适的靶标(位点)进行检测。
截至3月12日,国家药监局审批的10个核酸检测试剂都是对两个位点同时进行检测,即基于M蛋白的基因点和基于C蛋白的基因点。
但实际中,由于新冠病毒基因的变异性特别高,当从一个人传染到下一个人时,或许基因已经发生了突变。这导致在检测位点不变的情况下,探针就会被突变的基因“蒙蔽”,让它“从眼皮子底下溜走”,从而出现检测结果“假阴性”的现象。
为此,项目团队考虑通过增设检测位点,即扩大“撒网面积”的方式提高试剂盒的灵敏性。
多增设一个位点,对于项目研发而言,难度呈“几何级增长”。
杜鸿为此解释说,首先,位点不能随意选择,要考虑在基因保守区即不容易发生基因突变的位置选择,这本身就有一定难度。更为关键的是,还要考虑到不同位点之间的匹配性,若匹配性不佳,意味着选取的基因无法在同一温度、液体浓度等环境下进行扩增,导致扩增环节的失败,从而直接导致检测失败。
毫无疑问,位点数越多,实现彼此之间的匹配就越难。
项目团队在研究2019-nCoV全基因组序列的基础上,通过建立错配耐受的定量PCR方法和错配耐受的环介导等温扩增技术,建立和优化了核酸扩增反应体系,最终成功破冰,成功增设基于S基因的位点,将靶位扩增为3个。
杜鸿告诉记者,目前试剂盒已基本完成开发,尚需优化和临床样本的验证,提高核酸检测灵敏性、降低检测“假阴性”的比率还无法给出具体的数值。
预测项目研发半年后可完成
自2月28日获得苏州市新型冠状病毒感染应急防治科技专项研究立项以来,“新冠病毒POCT核酸系统”项目团队快马加鞭推进研发。目前,已建立起包括试剂盒在内的整个耐突变新型冠状病毒扩增体系,设备样机也正在准备中。
之所以在这么短的时间内,项目取得如此神速的进展,与核总医院多年来在病原微生物检测方面雄厚的研发实力密不可分。
“我们的研发大多是在临床微生物学重点实验室开展的。”据杜鸿介绍,该实验室目前是苏州唯一的临床微生物学重点实验室,主要围绕临床常见的重要病原微生物如碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的早期快速诊断、耐药基因的早期快速检测,以及临床少见菌、疑难菌包括一些病毒的检测鉴定等方向开展研究工作。在病毒检测的研究中,实验室和中国科学院苏州生物医学工程技术研究所、上海巴士德所建立了长期合作。
实验室获得的许多科研成果,直接反馈到此次研发中。
“此前,我们团队在做艾滋病毒检测时,首次尝试采用了恒温扩增技术,在扩增体系的优化例如离子浓度、酶浓度的设定等方面,摸索出了一定的经验。”杜鸿表示,这帮助他们很快实现了新冠病毒扩增体系的建立。
不只有技术上的优势,更有人才上的实力。
“比如,试剂盒探针的设计,主要依靠研发人员的技术分析,对个人能力的考验非常大。”杜鸿说。
其实作为项目负责人的杜鸿,其本人在病原微生物检测领域深钻就已经有十多年,主持国家自然科学基金、江苏省科技厅重点研发项目、江苏省自然科学基金等各级各类课题十余项。
对于此次项目,杜鸿依然有着一贯以来的高要求。
他告诉记者,项目预计再用半年时间来完成,包括用2个月时间继续优化耐突变新型冠状病毒扩增体系,2个月实现核酸快速检测芯片的研发,最后2个月内实现临床核酸样本验证。项目团队正在和时间赛跑,努力尽早让研究成果应用于临床。